style="width:8.81389in;height:8.02708in" /> 本文是学习GB-T 34713-2017 化学品 体外毒性试验替代方法的验证程序和原则. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了化学品体外毒性试验替代方法的验证程序和原则。
本标准适用于化学品的各种体外毒性试验替代方法。
下列术语和定义适用于本文件。
2.1
替 代 alternative
改善试验设计和提高试验效率，以减少某一试验所需动物的数量(减少替代),减少动物的应激(优
化替代),以及完全停止某一试验的动物使用(绝对替代)。
2.2
替代试验 alternative testing
利用游离器官、培养的细胞或细胞器、生物模拟系统，以减少、优化或代替传统的动物试验，进行毒
理学评价、功效性评价和其他生命科学研究的试验。
2.3
验证 validation
出于一定目的，对某一方法或程序可靠性和相关性进行评估的过程。
附录 A 提供了皮肤腐蚀性体外试验验证程序应用示例。
来自实验室的替代方法开发与建立，包括：
a) 方法目的说明；
b) 方法需求说明；
c) 方法起源；
d) 应用范围说明；
e) 在验证研究中需要说明的情况；
f) 测试方法草案。
预验证过程是一种小规模的实验室间研究，为了优化测试方法草案和预测模型，以获得方法相关性
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和可靠性的初步评价。测试优化是为了确保方法符合动物替代的原则，并且符合随后的正式验证研究
要求，节省人力和物力。
预验证的目的是形成一个优化的测试方法草案，并能够在正式验证中进行进一步评估。
主要阶段包括：
a)
初步计划：包括定义方法原理和测试目的、起草草案、收集数据结果、确定评价模型、考核和评
估实验室资质等。
b) 方法优化：测试方法草案和评价模型需在有经验的实验室进行优化。
c)
方法转化：将方法移植到第二个实验室，进行实验室内和实验室间重复性和再现性评价，并对
方法草案和评价模型进行必要的优化。
d)
方法执行：在三个或更多的实验室进行盲样测试，对方法相关性和可靠性进行评价，分析实验
数据，形成优化的测试方法草案。
向相关监管部门或国际组织申请替代方法的正式验证，并提供预验证的详细资料和数据。通过替
代方法的验证申请后，可由权威机构组织对替代方法进行正式验证。
为获取更准确的方法相关性和可靠性评价，验证包括盲样测试，需在具备能力的实验室间进行。标
准样品验证是在预验证的基础上，用盲样对更多的标准样品进行测试。
主要阶段包括：
a)
成立验证管理小组：定义验证研究的目的，设计测试方法草案，选择参与验证的实验室，标准样
品选择和分发，建立管理评估和监管程序。
b)
预备测试程序：保留数据记录，选择标准样品，并对标准样品进行编码和分发标准样品。
c) 测试编码标准样品：测试方法在实验室间的运行性能，数据的处理和评估。
d)
方法评估：数据采集和分析、总结和分析测试结果，用评估模型验证数据，对测试方法草案和实
验数据进行专家评议，同意、修订或否决测试方法草案。
测试数据和结果应可重复，需通过相关专家评议。测试方法草案需召开专家评审会，由评审专家公
开听取方法草案背景评估意见、方法评估意见，对测试方法草案推荐意见进行公开评议。
向监管部门提交测试方法的申请，监管部门对替代技术方法进行考虑和评估。
主要程序包括：
a) 准备报告；
b) 准备支持数据；
c) 准备公布结果。
整体验证过程中有4个关键点，图1为从测试开发到验证，测试方法优化中的关键点步骤。
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图 1 从测试方法开发到验证，测试方法优化中的关键点步骤
每个测试要点(例如标准样品暴露时间、组织病理学、临床化学等)都需仔细研究和评估，来确定最
佳条件/细节。
至少有一个实验室是独立于测试方法开发实验室，检测初步评估和审查该方法在实验室间的可转
化性和再现性。若测试方法未能提供足够的可再现性，视再现性的程度，考虑是否进一步优化。
若替代方法在相关性方面而不是重复性方面显示不可接受的性能，是由于替代方法方案存在不足。
如进一步试验优化不能解决性能问题，则应考虑重新设计部分测试方法，或考虑否决测试方法。
在某些情况下，预验证结果不足以进行进一步的验证，但替代方法再精炼后仍被看好，如果这个阶
段用适当的方法处理可解决方法不完善的地方，则可开展主要的验证，在此情况下可开展多个主要验证
研究。
对替代测试方法的说明包括：
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a) 方法的科学目的说明；
b) 方法的基本原理描述；
c) 已知的或推测的机制原理解释；
d) 训练集(化合物结构+完整的数据集)的说明；
e) 测试终点说明和详细描述；
f) 应用范围。
5.2 替代方法终点与目的生物指标之间关系的描述
包括测试方法测量的效应的科学相关性的说明，并与特定类型的目的效应/毒性的反应机制(生物
学的)或效应(相关的)有关。虽然关联可能是机制的或相关的，最好对与效应/毒性相关的生物相关性
的测试方法进行评估。
5.3 替代方法的详细方案和标准操作规程(SOPs)
替代方案要足够详细，具体包括：
a) 标准操作规程(SOPs);
b)
所需测试材料描述，包括适用测试所需要使用的特定细胞系或人工构造物或动物品系；
c) 测试内容和测试过程描述；
d) 数据分析描述；
e) 数据评价标准；
f) 方法运行可接受的标准，如阳性和阴性控制响应的描述；
g) 测试结果适用种属列表的描述；
h)
已知测试限制性的描述，包括测试能够或者不能够准确评定的材料分类描述等。
5.4 替代方法实验室内和实验室间重现性确证
需有数据表明随着时间变化，方法在实验室内和实验室间重现性和变异性。需对生物差异性影响
测试方法重现性程度说明。
替代方法运行性的说明需基于标准样品所进行的测试，而标准样品应代表测试方法所应用的物质
类型。已对足够的标准样品进行了测试，测试时采用代号以排除人为偏见因素。
替代方法的运行性应已经过评估，评估的种属与毒性测试的相关性。
替代方法应已有足够数据，能够对提议的替代方法与被替代方法的性能和可适应性比对分析。
5. 7 替代方法验证数据最好符合良好实验室规范(GLP)
和良好细胞培养规范(GCCP)
适当时，所有支持替代方法验证的数据应遵从良好实验室规范(GLP)
原则。数据采集不符合 GLP
原则的，应明确说明，并说明对测试方法验证状态的潜在影响。若涉及细胞培养和检测操作，最好符合
良好细胞培养规范。
所有用来支持替代方法验证的测试数据，应能够进行重复和评估，包括：
a) 具有详细的方法草案，并且向公众开放；
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b)
所有支持替代方法验证评估的数据应汇总并可获取，允许在合适的条件下独立评审；
c)
测试方法描述应足够详细，使得独立实验室根据方法过程描述能够获得同等数据；
d)
提供基准测试程序数据，以便独立实验室自身能够对测试方案遵循程度进行评价；
e) 测试方法和测试结果应该在一个独立的、同行认可的公开刊物上公布；
f) 方法运行可接受的标准。
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(资料性附录)
皮肤腐蚀性体外试验验证程序应用示例
A.1 简介
体外皮肤腐蚀性试验中共有五项试验需执行预验证、验证和附加专题研究。在1994年～1995年
的预验证阶段，对三项试验：大鼠皮肤 TER、CORROSITEX 试验和 Skin²
人体皮肤模型试验进行了评
估。在两至三所实验室中对五十种经过编码处理的标准样品进行了试验。所有的试验均表现出了充分
的可再现性并且对具有体内皮肤腐蚀性契合的趋势。参与审查 ECVAM
第6号研讨会成果的专家建
议对方法作进一步优化之后进入正式的验证研究阶段。专家选择和收集了60种新的标准样品(以实验
兔的体内试验数据作为依据)。然后针对预验证研究中的三项试验开展了正式的验证研究工作，在
1996年～1997年加入了第二项皮肤模型试验(EPISKIN),
并在1998年进行了评估并公布了结果。然
而CORROSITEX 在适用性方面的存在局限性并且缺乏预测性，同时所采用的 Skin²
试验方案(已被
US DOT认可)又过于敏感，TER 试验和 EPISKIN
试验则均达到了预定的认可标准。在验证研究阶
段，相关部门决定另行开展小规模专题研究活动：由于60种试验标准样品的SAR
数据中给出了体内和 体外数据(来自验证研究),因此决定新增 pH
值和碱贮量测定内容并采用 OECD TG 404 中规定的 OECD
分层化试验方法。此项研究表明利用SAR、pH
值和体外数据可100%检出腐蚀性标准样品。
由于受生产商的营销决策影响，未能获得1996年～1997年的 Skin² 和 EPISKIN
数据，因此 ECVAM
支持开展一种新型的"追赶式"验证研究。这种追赶式研究用于判定是否可以将一种与已被成功验证的
EPISKIN 所使用的方法相似的试验方案用于另一种人体皮肤模型。研究结果与
EPISKIN 极为相似，
从而确认了 OECD
试验导则431可适用于不同皮肤模型(包括新模型)的假设及试验设计的稳健性。
A.2 方法验证程序应用说明
A.2.1 提出的经验证的试验方法的介绍和基本原理
皮肤腐蚀是指皮肤接触了《联合国全球化学品统一分类和标签制度》(GHS)
中规定的受试物质后
导致的不可逆的组织损伤。皮肤腐蚀性评价通常需要使用实验动物(实验兔)。考虑到动物试验中遭受
的痛苦和伤害，OECD 试验导则(TG
404)的2002年修订版中提出允许使用体外替代方法测试皮肤腐
蚀性。
某项替代方法能够按照法规的目的用于皮肤腐蚀替代试验，第一步需要进行预验证研究，接下来是
进行用来评估体外皮肤腐蚀试验方法的正式验证研究。根据这些研究的结果和其他出版的文献，建议
使用两项体外试验来进行体内皮肤腐蚀性评估：人体皮肤模型试验(本方法)和经皮电阻试验(OECD
试验导则430)。验证研究表明，如果能够得到物理化学方面的支持信息，那些使用人体皮肤模型试验
则可以很好地区分已知的皮肤腐蚀物和非皮肤腐蚀物。
A.2.2 试验方法方案的组成部分
目前已对体内皮肤腐蚀机制进行了充分了解。
一种机制是强酸强碱类物质导致皮肤屏障以及之下
的活性皮肤细胞出现破坏性的"吸收"现象，另一种主要的机制则是具有很强的皮肤渗透性的化学品同
时还拥有细胞毒性/反应性。在这种情况下，有毒化学品迅速到达皮肤的底层从而形成坏死(不可逆)。
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这两种体内机制都可以利用特定的短期细胞毒性试验并通过检测人体皮肤模型的细胞活性予以检出
(前提是角质层处于良好培养状态)。
受试物质以外敷的形式作用于三维人体皮肤模型上，而此模型至少含有角质层功能正常的重构表
皮层。如果某一物质能够在规定的接触时间内让细胞活性(例如利用MTT
还原试验进行测定)降至规
定阈值之下，则可将该物质确定为腐蚀性物质。
A.2.3 用于验证提议的试验方法的标准样品
预验证研究(1993—
1994):按照可利用性及明确的"腐蚀性"或"无腐蚀性"分类标准挑选了50种受
试标准样品。这些受试标准样品(25种腐蚀性标准样品，25种无腐蚀性标准样品)大多可通过商业途径
获得。 Unilever
ESL对所有的受试样品进行了编码，参与者并不知道这些编码的涵义。为了确保原始
数据的完整性，已在编码破译之前向 ECVAM 递交了试验结果。
正式验证研究(1996—
1998):挑选了60种能够代表所有与皮肤腐蚀性相关标准样品种类的标准样
品(30种腐蚀性标准样品，30种无腐蚀性标准样品):有机酸、有机碱、中性有机物、酚类、无机酸、无机
碱、无机盐、亲电体和肥皂/表面活性剂。选择的依据主要来自于 ECETOC
第66号报告中给出的体内
数据，同时体外国际(美国尔湾 IVI)也提供了一些体内数据。所有的受试样品均由
BIBRA Intl进行编
码和配发，参与者并不知道编码的含义。为了确保原始数据的完整性，已在编码破译之前向
ECVAM
递交了试验结果。
OECD TG 404 分层试验方法专题研究(1997—
1998):在"专题研究"中对正式验证研究所采用的
60种标准样品进行了pH、 酸/碱贮量盲测评估。
追赶式验证研究(1997—
1999):使用了50种标准样品(25种腐蚀性标准样品/25种无腐蚀性标准
样品)来适应和优化 EpiDerm 方案和预测模型，在选择时尽量避免与正式 ECVAM
验证研究所选用的
标准样品雷同。在最后的盲测试验中(在三家实验室中进行性能评估),使用了从正式验证研究中选出
的代表性子集。
A.2.4 用于评估提议试验方法准确性的体内参考数据(在适当的情况下)
预验证研究(1993—
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